A folyadék biopsziák vérrel nem tumoros szöveteket használnak - a rák diagnosztizálására
Tipikusan a tumorokat szöveti biopsziák alkalmazásával vizsgáljuk. Egy kis mintát veszünk a tumorból és genotipizáljuk, vagy genetikai sminkre analizáljuk. A probléma ezzel a megközelítéssel az, hogy a biopszió tumorok kihívást jelenthetnek. Továbbá, a tumor biopszia csak egy pillanatfelvételt biztosít a tumorról.
A Discovery Medicine 2015-ben írva a Labgaa és a szerzők a hagyományos tumor biopsziáról beszélnek:
Nyilvánvaló okokból nehézséget okoz a tumor fejlődése szekvenciális biopsziákkal. A biopszia csak a tumor egyetlen foltját tükrözi, és ezért nem valószínű, hogy a nagy daganatok szomatikus mutációinak teljes spektrumát képviseli. Egy alternatíva lenne, ha több biopsziát kapna ugyanarra a daganatra, de ez a lehetőség nem tűnik sem reálisnak, sem pontosnak.
A folyadékbiopszia a keringő DNS (ctDNA) és egyéb tumor melléktermékek mérését jelenti a rákos betegek vérmintáin. Ez a kialakuló diagnosztikai megközelítés ígéretes, hogy gyors, nem invazív és költséghatékony.
A folyékony biopszia története
1948-ban, Mandel és Métais, egy pár francia kutató először azonosította a ctDNA-t az egészséges emberek vérében. Ez a felfedezés idő előtt állt, és csak évtizedekkel később, a ctDNS-t tovább kutatták.
1977-ben Leon és kollégái először a rákos betegek vérében megnövekedett mennyiségű ctDNS-t azonosítottak.
1989-re Stroun és munkatársai a neoplasztikus (azaz rákos) jellemzőket azonosította a vérben. E felfedezések után számos más csoport azonosított specifikus mutációt tumorszuppresszorokban és onkogénekben, mikroszatellita instabilitást és DNS-metilezést, amelyek igazolták, hogy a ctDNS tumorokká válik a keringésbe.
Bár tudjuk, hogy a tumorsejtekből származó ctDNS a vérben kering, a DNS eredete, felszabadulási sebessége és felszabadulási mechanizmusa nem tisztázott, és a kutatások ellentmondásos eredményeket hoznak. Néhány kutatás azt sugallja, hogy a rosszindulatú daganatok több halott rákos sejtet tartalmaznak, és több ctDNS-t szabadítanak fel. Néhány kutatás azonban azt sugallja, hogy minden sejt felszabadítja a ctDNA-t. Mindazonáltal valószínűnek tűnik, hogy a rákos daganatok felszabadítják a ctDNS fokozott szintjét a vérben, és így a ctDNA a rák jó biomarkere.
A nehéz fragmentáció és a vér alacsony koncentrációja miatt a ctDNS-t nehéz izolálni és elemezni. A szérum és a plazma minták közötti ctDNS-koncentráció eltérés mutatkozik. Úgy tűnik, hogy a vérszérum helyett a vérplazma a ctDNS jobb forrása. Umetani és munkatársai által végzett vizsgálatok szerint a ctDNS-koncentrációk következetesen alacsonyak a plazmában a szérumhoz képest, mivel a tisztítás során a keringő DNS esetleges elvesztése következik be, mivel a koaguláció és más fehérjék a minták előkészítése során megszűnnek.
Heitzer és munkatársai szerint itt vannak olyan konkrét kérdések, amelyeket meg kell oldani a ctDNA diagnosztikai potenciáljának kihasználására:
Először is a preanalitikai eljárásokat szabványosítani kell .... Kiváló kiválasztási módszer, amely biztosítja a megfelelő mennyiségű kiváló minőségű DNS kivonását, kritikus, és kimutatták, hogy a vérmintavétel és feldolgozás előtti elemző tényezők erősen befolyásolhatják a DNS-hozamot .... Másodszor, az egyik legfontosabb kérdés a mennyiségi módszerek harmonizációjának hiánya. A különböző mennyiségi meghatározási módszerek, ... különböző eredményeket produkálnak, mivel ezek a mérések teljes vagy csak amplifikáló DNS-t céloznak meg. Harmadszor kevésbé ismeretes a ctDNS felszabadulásának eredete és részletes mechanizmusa, és a legtöbb tanulmányban olyan eseményeket kevernek össze, amelyek szintén hozzájárulhatnak a ctDNS felszabadulásához.
Célzott és nem célzott megközelítések
Jelenleg a vérplazma (vagy szérum) ctDNS analízisére két fő megközelítés van. Az első megközelítés célzott, és konkrét genetikai változásokat keres a daganatokra vonatkozóan. A második megközelítés nem célzott, és genomszéles elemzést igényel, amely a ctDNS-t tükrözi a rákra. Alternatív megoldásként az exome szekvenálást költséghatékonyabb, nem célzott megközelítésként alkalmazzák. A bevételek a DNS azon részei, amelyek átíródnak, hogy fehérjéket alkossanak.
Célzott megközelítésekkel a szérumot az ismert genetikai mutációkra elemezzük kis számú vezetőmutáció esetén.
A vezető mutációk a genomban mutációkat jelentik, amelyek elősegítik vagy "meghajtják" a rákos sejtek növekedését. Ezek a mutációk közé tartozik a KRAS vagy az EGFR .
Az elmúlt évek technológiai fejlődésének köszönhetően a genom analízisére irányuló célzott megközelítések kis mennyiségű ctDNS-hez megvalósultak. Ezek a technológiák közé tartozik az ARMS (amplifikációs refrakter mutációs rendszer); digitális PCR (dPCR); gyöngyök, emulziók, erősítés és mágnesesség (BEAMing); és a mély szekvenálás (CAPP-Seq).
Annak ellenére, hogy a célzott megközelítés lehetővé tette a technológiai fejlődést, a célzott megközelítés csak néhány pozíciót céloz meg (hotspotok), és sok vezetőmutációt, például tumorszuppresszor gént veszít.
A folyékony biopszia nem célzott megközelítésének fő előnye, hogy minden páciensnél alkalmazható, mivel a teszt nem támaszkodik a visszatérő genetikai változásokra. A visszatérő genetikai változások nem terjednek ki minden rákra, és nem specifikus rákszignatúrák. Ennek a megközelítésnek azonban nincs analitikus érzékenysége és a tumor genomok átfogó elemzése még nem lehetséges.
Megjegyzendő, hogy az egész genom szekvenálásának ára lényegesen csökkent. 2006-ban az egész genom szekvenálásának ára körülbelül 300 000 dollár (USD) volt. 2017-re a költség genomenként megközelítőleg 1000 dollárra (USD) csökkent, beleértve a reagenseket és a szekvenáló gépek amortizációját.
A folyékony biopszia klinikai hasznossága
A ctDNS alkalmazására irányuló kezdeti erőfeszítések diagnosztikusak és összehasonlították az egészséges betegek szintjét a rákos betegek vagy a jóindulatú betegséggel rendelkezőkével. Ezen erőfeszítések eredményeit összekeverték, és csak néhány tanulmány mutatott szignifikáns különbséget a rák, a betegségtől mentes állapot vagy a visszaesés tekintetében.
Az ok, amiért a ctDNS csak a rák diagnosztizálásához használható, mert a változó mennyiségű ctDNS származik tumorokból. Nem minden daganat "ugyanabban az összegben" tölti be a DNS-t. Általánosságban, a fejlettebb, széles körben elterjedt tumorok több DNS-t bocsátanak a keringésbe, mint a korai, lokalizált tumorok. Ezenkívül a különböző típusú tumorok különböző mennyiségű DNS-t bocsátanak a keringésbe. A tumorból származó keringő DNS frakciója széles körben változó a vizsgálatok és a rák típusok között, 0,01 és 93% között. Fontos megjegyezni, hogy általában csak a ctDNS kisebb része származik a daganatból, a többi pedig a normális szövetekből származik.
A keringő DNS alkalmazható a betegség prognosztikai markerjeként. A keringő DNS-t fel lehet használni a rákban bekövetkező változások megfigyelésére. Például egy vizsgálat azt mutatta, hogy a colorectalis rákban szenvedő betegek kétéves túlélési aránya (azaz a vastagbélrákos diagnózis után legalább két évig életben maradó betegek száma) és a KRAS hotspot mutációk 100% -ban voltak azokban, megfelelő cirkuláló DNS. Ezenkívül lehetséges, hogy a közeljövőben a keringő DNS felhasználható a prekancerózus elváltozások megfigyelésére.
A keringő DNS-t a terápiára adott válasz figyelemmel kísérésére is fel lehet használni. Mivel a keringő DNS a daganatok genetikai összetételének jobb átfogó képet nyújt, ez a DNS valószínűleg diagnosztikus DNS-t tartalmaz, amelyet a magzati tumoroktól kapott diagnosztikus DNS helyett alkalmazhatunk.
Most vessünk egy pillantást a folyadék biopszia konkrét példáira.
Guardant360
A Guardant Health kifejlesztett egy olyan tesztet, amely a következő generációs szekvenciát alkalmazza a DNS keringő DNS-hez a 73 rákkal kapcsolatos gén mutációi és kromoszómális átrendeződése szempontjából. A Guardant Health publikált egy tanulmányt, amely a folyadékbiopszia hasznosságát jelentette az onkológiában. A vizsgálatban 15 000, 50 kombinált tumortípusú vérmintát használtunk.
A folyadékbiopsziás vizsgálat eredményei nagyrészt a tumorbiopsziában megfigyelt génváltozásokhoz igazodtak.
Az NIH szerint:
A Guardant360 ugyanazokat a kritikus mutációkat azonosította fontos rákkal kapcsolatos génekben, mint például az EGFR, a BRAF, a KRAS és a PIK3CA , nagyon hasonlítanak a tumorbiopsziás mintákban korábban azonosított gyakoriságokhoz, statisztikailag 94% és 99% között.
Továbbá az NIH szerint a kutatók a következőket jelentették:
A vizsgálat egy második komponensében a kutatók közel 400 beteget értékeltek, akiknek többsége tüdő- vagy vastagbélrák volt, és mindkettő rendelkezett a vér ctDNS és tumorsejt DNS eredményével, és hasonlította össze a genomiális változások mintáit. A folyadékbiopszia teljes pontossága a tumorbiopsziás elemzések eredményeihez képest 87% volt. A pontosság 98% -ra emelkedett, amikor a vért és a tumor mintákat egymás után 6 hónapon belül összegyűjtötték.
A Guardant360 pontos volt, bár a vérben lévő keringő DNS szintje alacsony volt. Gyakran előfordul, hogy a keringő tumor DNS csak a vér DNS-jének 0,4% -át teszi ki.
Összességében folyékony biopsziával a Guardant kutatók képesek azonosítani azokat a tumor markereket, amelyek a betegek 67% -ában orvosok kezelhetik a kezelést. Ezek a betegek jogosultak az FDA által jóváhagyott kezelésekre, valamint vizsgálati terápiákra.
ctDNS és tüdőrák
2016-ban az FDA jóváhagyta a tüdőrákos betegek keringő DNS-je EGFR- mutációinak kimutatására szolgáló cobas EGFR-mutációs tesztet. Ez a teszt volt az első FDA által jóváhagyott folyadékbiopszia és azonosította azokat a betegeket, akik az erlotinib (Tarceva), a termálinib (Gilotrif) és a gefitinib (Iressa) első vonalbeli kezelésként alkalmazhatók célzott terápiákkal, és az osimeritinib (Tagrisso) második vonalbeli kezelés. Ezek a célzott terápiák rákos sejteket támadnak specifikus EGFR- mutációkkal.
Fontos megjegyezni, hogy a hamis negatív eredmények nagy száma miatt az FDA azt javasolja, hogy a szövettani biopsziás mintát egy negatív folyadékbiopsziás betegből is bevegyék.
ctDNS és májrák
A májtumorra haldokló emberek száma az elmúlt 20 évben nőtt. Jelenleg a májrák a világon a rákos halál második legfontosabb oka. Nincsenek jó biomarkerek a máj vagy a májsejt (HCC) rák kimutatására és elemzésére. A keringő DNS jó biomarker lehet a májrákban.
Tekintsük a Lagbaa és a szerzők alábbi idézetét a cirkuláló DNS használatának potenciális lehetőségeiről a májrák diagnosztizálására:
A RASSF1A, p15 és p16 hyperpermetilációját korai diagnosztikai eszközökként javasolják egy retrospektív vizsgálatban, amely 50 HCC-es beteget tartalmaz. Négy aberrantly metilált gén (APC, GSTP1, RASSF1A és SFRP1) aláírását is vizsgálták a diagnosztikai pontosság érdekében, míg a RASSF1A metilezését prognosztikai biomarkerként jelentették. A későbbi vizsgálatok során a cDNS-t mélyen szekvenáló technológiák alkalmazásával vizsgálták HCC-páciensekben. Kifejezetten két, a vérkeringés idején a HCC korábbi története nélkül két HBV-hordozóban kimutatták az aberráns DNS-számot, de a HCC-t a követés során fejlesztették ki. Ez a megállapítás kinyitotta az ajtót, hogy értékelje a ctDNS kopasz számának változását, mint a korai HCC kimutatásának szűrőeszközeit.
Egy Word From
A folyékony biopsziák a genomiális diagnózis izgalmas új megközelítése. Jelenleg bizonyos folyékony biopsziák, amelyek átfogó molekuláris profilképzést nyújtanak, az orvosok rendelkezésére állnak, hogy kiegészítsék a szövetbiopsziával nyert genetikai információkat. Vannak bizonyos folyadék biopsziák is, amelyeket a szövet biopszia helyett alkalmazhatunk - ha a szövettani biopsziák nem állnak rendelkezésre.
Fontos megjegyezni, hogy jelenleg folyik számos folyadékbiopsziás vizsgálat, és több kutatásra van szükség ahhoz, hogy ki lehessen terjeszteni a beavatkozás terápiás hasznosságát.
> Források:
> A daganatok genetikai változásainak vérvizsgálata az ígéretet alternatív módon mutatja be a tumorbiopsziához. NIH.
> Heitzer E, Ulz P, Geigl JB. Keringő tumor DNS mint folyékony biopszia a rák. Klinikai kémia. 2015-ig; 61: 112-123. Doi: 10,1373 / clinchem.2014,222679
> Lagbaa J, Villanueva A. Folyékony biopszia májrákban. Discovery Medicine. 2015-ig; 19 (105): 263-73.
> Folyadék biopszia: DNS-vektor alkalmazása a rák kimutatására, nyomon követésére és kezelésére. NIH.
> Umetani N. et al. A szérumban szabadon keringő DNS nagyobb mennyisége, mint a plazmában, nem elsősorban a szennyezett idegen DNS okozza az elválasztás során. Ann NY Acad Sci. 2006; 1075: 299-307.
> Wellstein A. Általános alapelvek a rák gyógyszeres terápiájában. In: Brunton LL, Hilal-Dandan R, Knollmann BC. szerk. Goodman & Gilman: Therapeutics Farmakológiai Alapja, 13e New York, NY: McGraw-Hill.